视黄醛脱氢酶（ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH2）检测方法详解：从原理到应用

 

视黄醛脱氢酶（ALDHs）是一个庞大的酶家族，其中ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH2因其在视黄酸合成、酒精代谢、干细胞生物学及肿瘤耐药中的关键作用而备受关注。准确检测这些酶的活性与表达水平，对于基础研究、临床诊断和新药开发至关重要。本文将系统详解ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH2的检测方法，涵盖其原理、步骤、优缺点及选择策略。

 

一、 为什么检测ALDH1和ALDH2如此重要？

 

在深入方法之前，理解检测的意义能帮助我们选择正确的策略。

 

   ALDH1A1/A2： 是合成全反式视黄酸（ATRA）的关键酶。ATRA是维生素A的活性代谢物，调控细胞增殖、分化和凋亡。ALDH1A1高表达常被视为干细胞的标志物，并与多种癌症（如肝癌、乳腺癌、肺癌）的化疗耐药和不良预后相关。ALDH1A2则在胚胎发育和组织特异性视黄酸合成中起主导作用。

   ALDH2： 是线粒体中乙醛脱氢酶的关键亚型，负责将酒精代谢产生的有毒乙醛转化为无害的乙酸。ALDH22基因多态性（rs671）在东亚人群中非常常见，会导致酶活性显著降低，与酒精 flush反应（喝酒脸红）及酒精相关疾病（如食管癌）风险增高密切相关。

 

因此，检测这些酶的目的可归纳为：

1.  活性评估： 直接衡量酶的催化能力，如评估ALDH2缺陷型个体的代谢能力。

2.  表达水平分析： 在mRNA或蛋白水平上定量，如研究ALDH1A1在肿瘤组织中的表达情况。

3.  细胞分选： 分离具有高ALDH活性的干细胞或肿瘤干细胞群体。

4.  基因分型： 确定个体的ALDH2基因型。

 

二、 主要检测方法详解

 

检测方法可分为三大类：酶活性检测、蛋白水平检测和基因/mRNA水平检测。

 

1. 酶活性检测

 

这类方法直接反映酶的生物学功能，是功能学研究中的金标准。

 

（1）分光光度法

   原理： ALDH催化醛类底物（如乙醛、视黄醛）氧化，同时将辅酶NAD⁺还原为NADH。NADH在340nm波长下有特征吸收峰，通过监测单位时间内340nm吸光度（OD值）的增加速率，即可计算出酶活性。

   步骤：

    1.  制备待测样本（如细胞裂解液、组织匀浆液）。

    2.  建立反应体系：包含缓冲液、NAD⁺、底物（针对不同ALDH选择：乙醛常用于ALDH2，视黄醛或丙醛用于ALDH1A1/A2）和样本。

    3.  在分光光度计中混合，立即于340nm下连续监测吸光度变化数分钟。

    4.  根据公式计算酶活性（通常以每分钟生成1 μmol NADH所需的酶量定义为1个活性单位）。

   优点： 操作相对简单、成本低、可定量、能直接反映总活性。

   缺点： 无法在单细胞水平上进行检测，不能区分不同ALDH亚型（若样本中含多种ALDH），灵敏度相对较低。

 

（2）荧光法

   原理： 利用荧光底物（如BODIPY氨基乙醛，BAAA）。ALDH酶将无荧光或弱荧光的BAAA转化为强荧光的BODIPY氨基乙酸（BAA），通过流式细胞术或荧光显微镜检测荧光强度，从而反映细胞内ALDH的活性。

   代表技术：ALDEFLUOR™ 试剂盒

       这是检测和分选ALDH高活性细胞（尤其是ALDH1A1阳性细胞）的金标准。

       步骤： 将活细胞与ALDEFLUOR底物（BAAA）共孵育，同时设置对照组（加入ALDH特异性抑制剂DEAB）。ALDH高活性的细胞会将底物转化为强荧光产物并滞留于细胞内。通过流式细胞术分析荧光信号，并可分选出ALDH⁺细胞群。

   优点：

       单细胞水平： 可在混合细胞群体中识别和分选特定活性的细胞。

       高灵敏度： 非常适合稀有细胞（如肿瘤干细胞）的检测。

       保持细胞活性： 分选后的细胞可用于后续功能实验。

   缺点： 试剂盒昂贵，需要流式细胞仪等专业设备。

 

2. 蛋白水平检测

 

这类方法检测的是酶蛋白的数量而非活性。

 

（1）Western Blot（蛋白质印迹）

   原理： 通过凝胶电泳分离样本中的总蛋白，转膜后利用针对ALDH1A1、ALDH1A2或ALDH2的特异性一抗进行杂交，再用标记的二抗进行检测，通过化学发光或荧光信号显示目标条带的有无和强弱。

   优点： 特异性高，可区分不同的ALDH亚型；半定量；技术成熟，实验室常用。

   缺点： 操作繁琐，通量低；定量准确性不如ELISA；不能提供活性信息。

 

（2）免疫组织化学（IHC） / 免疫细胞化学（ICC）

   原理： 在组织切片（IHC）或细胞爬片（ICC）上，利用特异性抗体与目标ALDH蛋白结合，并通过显色或荧光反应，在显微镜下观察蛋白的定位（如胞质、线粒体）和表达丰度。

   优点： 能提供空间定位信息，可直观看到蛋白在特定组织区域或细胞中的表达情况，是临床病理诊断的常用方法。

   缺点： 定量不精确，多为半定量评分（如Hscore）；结果判读具有一定主观性。

 

（3）酶联免疫吸附测定（ELISA）

   原理： 将特异性抗体包被在微孔板上，捕获样本中的ALDH蛋白，然后通过酶标二抗和底物反应产生颜色信号，其强度与ALDH蛋白浓度成正比。

   优点： 高灵敏度、高特异性、精确定量，适合检测血清、细胞上清或组织裂解液中的可溶性ALDH蛋白，通量高。

   缺点： 无法获得细胞定位信息，需要高质量的商业化试剂盒。

 

3. 基因/mRNA水平检测

 

这类方法检测的是酶的生产蓝图或指令水平。

 

（1）实时定量PCR（qRTPCR）

   原理： 从样本中提取总RNA，逆转录为cDNA，再利用针对ALDH1A1、ALDH1A2或ALDH2 mRNA的特异性引物和探针进行PCR扩增，通过实时监测荧光信号来定量mRNA的拷贝数。

   优点： 高灵敏度、高精度，可检测非常微量的mRNA表达差异；通量高，速度快。

   缺点： mRNA水平不一定与蛋白水平或活性完全一致（存在转录后调控）；无法提供蛋白定位和活性信息。

 

（2）基因分型（特别是针对ALDH2）

   原理： ALDH2的功能主要受其1（正常）和2（缺陷）等位基因的控制。通过PCRRFLP（限制性片段长度多态性）、TaqMan探针法或DNA测序，可以快速确定个体的ALDH2基因型（1/1， 1/2， 2/2）。

   应用： 主要用于酒精代谢能力评估、疾病风险关联研究和个性化医疗（如指导硝酸甘油用药）。

 

三、 方法选择指南

 

如何选择最合适的方法取决于您的具体研究目的：

 

| 研究目的 | 推荐首选方法 | 补充/验证方法 |

| : | : | : |

| 分离ALDH高活性干细胞/肿瘤干细胞 | ALDEFLUOR™ + 流式细胞术 |  |

| 评估样本（如肝脏组织）总ALDH活性 | 分光光度法 |  |

| 比较不同样本间特定ALDH亚型蛋白表达量 | Western Blot 或 ELISA | ELISA定量更精确 |

| 观察ALDH蛋白在组织中的定位和表达 | 免疫组织化学（IHC） |  |

| 检测ALDH mRNA表达水平的差异 | qRTPCR |  |

| 判断个体的ALDH2代谢类型 | 基因分型（PCRbased） |  |

| 综合性研究（活性+表达） | ALDEFLUOR/Western Blot + qRTPCR | 多方法结合结论更可靠 |

 

四、 总结